Как измеряют подвижность макромолекул в живых клетках. Единое окно доступа к образовательным ресурсам Главная Каталог Библиотека Форум Новости Глоссарий Порталы О проекте Как измеряют подвижность макромолекул в живых клетках Текстовая версия документа PDF (размер: 161.1 КБ) Качество преобразования для различных документов может сильно различаться. Изображения (картинки, формулы, графики) в документе игнорируются. Защищённый документ не может быть преобразован. БИОЛОГИЯ КАК ИЗМЕРЯЮТ ПОДВИЖНОСТЬ МАКРОМОЛЕКУЛ В ЖИВЫХ КЛЕТКАХ А. С. СОБОЛЕВ Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова ПОСТАНОВКА ЗАДАЧИ HOW MOBILITY OF MACROMOLECULES Представим себе живую клетку в стадии G0 , то есть IN LIVING CELLS CAN BE MEASURED когда она вышла из митотического цикла, не делится, но активно функционирует. Таких клеток большинство A. S. SOBOLEV в нашем организме. Во многих из них идет активный синтез различных белков либо “на экспорт” (секретор- Problems, where a solution requires the mea- ные белки), либо для собственных нужд. Если вспом- surement of intracellular macromolecular нить, что синтез белка происходит в цитоплазме, точ- нее, на рибосомах, то можно задаться вопросом: как movement, are briefly described; among them: попадают вновь синтезированные белки в свои места nucleo-cytoplasmic transport and lateral назначения, отличные от места их синтеза? Невольно mobility of membrane receptors. Principles of напрашивается мысль, что должны существовать ка- two main methods are outlined: 1) Fluores- кие-то механизмы доставки этих белков по соответст- cence Recovery after Photobleaching; and вующим адресам (то есть доставка происходит не слу- чайно), причем, возможно, эти адреса “написаны” на 2) Fluorescent Confocal Laser Scanning Micros- самих белках. Эта мысль о существовании специаль- copy. Main results obtained with the use of ных транспортных систем для доставки белков по адре- these methods are listed. сам и о существовании самих адресов подтверждена за последние 10–15 лет широкими экспериментальными Описаны проблемы, решение которых тре- исследованиями. В статье нет возможности входить в подробности этого чрезвычайно увлекательного, по мне- бует измерения внутриклеточной подвиж- нию автора, раздела молекулярной биологии и биофизи- ности макромолекул, в том числе цито- ки клетки, рассмотрим лишь один, достаточно хорошо плазменно-ядерного транспорта и лате- изученный пример цитоплазменно-ядерного транспорта ральной подвижности мембранных рецеп- как иллюстрацию основных принципов транспорта. торов. Охарактеризованы принципы двух Как следует из названия, это транспорт из цитоплазмы в ядро клетки (и обратно). основных методов: восстановления флуо- ресценции после фотоотбеливания и ла- Около 15 лет назад элегантными опытами Кальде- рона и др. (1984 год) был обнаружен первый адрес, за- зерной конфокальной сканирующей микро- писываемый на белке, направляемом в ядро, – сигнал скопии. Перечислены основные результа- ядерной локализации, или кариофильная последова- ты, полученные с их помощью. тельность (имеется в виду последовательность амино- © Соболев А.С., 2000 кислот). Объектом исследований был белок вируса SV40 – большой ядерный Т-антиген, синтезируемый вскоре после проникновения вируса в клетку и нужный вирусу, чтобы эффективно использовать ядерный ап- парат клетки для собственной репликации. Этот белок, www.issep.rssi.ru как оказалось, содержит сигнал ядерной локализации из семи аминокислот (начиная со 124-й аминокислоты 2 С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 4 , 2 0 0 0 БИОЛОГИЯ с N-конца Т-антигена): пролин124-лизин-лизин-ли- ленными от них другими белками или структурами зин-аргинин-лизин-валин. Утрата этого участка или мембраны возможно после их сближения (эффектив- даже простая замена лизина126 на треонин126 драматиче- ного столкновения), осуществляемого за счет диффу- ски сказывается на внутриклеточной локализации изме- зии в мембране, то есть латеральной диффузии. Отсюда ненного таким образом белка: введенный в цитоплазму следовало также, что латеральная диффузия макромо- измененный белок вместо того, чтобы накапливаться в лекул в мембране может стать узким местом, стадией, ядре, как это делает нормальный Т-антиген, продолжа- лимитирующей скорость их взаимодействия. Поэтому ет оставаться в цитоплазме. В последующие годы были непосредственное измерение коэффициента латераль- выявлены многие десятки белков с сигналами ядерной ной диффузии (DL) белков в нативных мембранах или локализации. Понятно, что сигналом ядерной локали- даже плазматических мембранах живых клеток должно зации не исчерпывается весь механизм доставки белка было стать необходимой задачей, решение которой при- из цитоплазмы в ядро, как написанием адреса на кон- вело бы к пониманию механизмов взаимодействия верте с письмом не исчерпывается процесс доставки белков в мембранах. Мы снова приходим, но уже исхо- письма адресату. Как в последнем случае нужна дея- дя из другой отправной точки, к постановке задачи из- тельность почты, так и в первом – работа белков, уча- мерения подвижности макромолекул в живых клетках. ствующих в цитоплазменно-ядерном транспорте, боль- Несколько слов об основных требованиях к мето- шинство этих белков сосредоточено в порах ядерной дам измерения этой подвижности. Во-первых, так как мембраны. Даже если не вдаваться в какие-либо детали подход требует, чтобы объектами были либо целые жи- этой большой проблемы, то все равно напрашивается вые клетки (см. выше о цитоплазменно-ядерном мысль, что понимание механизмов регуляции процес- транспорте), либо по крайней мере нативные мембра- сов цитоплазменно-ядерного транспорта, а затем уп- ны (в некоторых случаях измерения DL), то имеет равление ими должны иметь существенное значение. смысл применение таких методов, которые позволяют По каким параметрам мы судим об эффективности проникнуть внутрь клетки или мембраны. Во-вторых, работы почты? Среди прочих для нас большое значе- методы, конечно, не должны повреждать объект иссле- ние имеет скорость доставки. То же и для транспорта из дования. В-третьих, поскольку объекты имеют микро- цитоплазмы в ядро. Экспериментатор, изменяя “текст” скопические размеры, то целесообразно использова- сигнала ядерной локализации, окружающий его “кон- ние микроскопии. Эти требования, таким образом, текст”, воздействуя на компоненты, участвующие в до- выводят на первый план оптические методы исследо- ставке ядерного белка, и т.д., должен иметь возмож- вания. ность следить за процессом транспорта и не просто Рассмотрим два наиболее широко применяемых следить, а измерять его скорости и сопоставлять их при метода измерения подвижности макромолекул в жи- разных условиях опыта. Отсюда возникает задача вых клетках: 1) метод восстановления флуоресценции иметь метод определения количественных характерис- после фотоотбеливания, или метод флуоресцентного тик транспорта белков (и вообще макромолекул) из ци- микрофотолиза, и 2) количественную флуоресцентную топлазмы живой клетки в ее ядро. Здесь не напрасно лазерную конфокальную сканирующую микроскопию. сказано о живой клетке: выяснилось, что во внутрикле- точном транспорте участвует множество компонентов МЕТОД ВОССТАНОВЛЕНИЯ клетки (белков, надмолекулярных комплексов и пр.), ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ причем немалое их число, по-видимому, еще предстоит ПОСЛЕ ФОТООТБЕЛИВАНИЯ (ВФПФ) открыть. Следовательно, чтобы не утратить какие-либо из компонентов-участников, нередко желательно ис- Исторически этот метод более ранний и вначале ис- следования проводить на целой живой функциониру- пользовался для измерения коэффициентов латераль- ющей клетке, а не на ее фрагментах. ной диффузии белков DL в плазматических мембранах Представим себе плазматическую мембрану клет- клеток. ки. В ней помимо других мембранных белков находят- Пометим интересующие нас белки плазматичес- ся рецепторы, осуществляющие первые этапы переда- кой мембраны клетки флуоресцентной меткой, напри- чи сигнала от гормона вовнутрь клетки. Рецепторы мер производным флуоресцеина. Поместим клетки с могут взаимодействовать с другими белками плазмати- флуоресцентно меченными белками под объектив лю- ческой мембраны, например с G-белками или адапти- минесцентного микроскопа (рис. 1), у которого свет, нами (белками так называемых покрытых ямок) и т.д. возбуждающий флуоресценцию, идет не от осветитель- Около 20 лет тому назад была высказана гипотеза ной лампы, а представляет собой сфокусированный (П. Кватреказас, 1976 год) “мобильного рецептора”, объективом луч лазера (для флуоресцеиновой метки, согласно которой взаимодействие рецепторов с уда- имеющей максимум поглощения при 490 нм, можно С О Б О Л Е В А . С . К А К И З М Е Р Я Ю Т П О Д В И Ж Н О С Т Ь М А К Р О М О Л Е К УЛ В Ж И В Ы Х К Л Е Т К А Х 3 БИОЛОГИЯ Интенсивность флуоресценции, I(t) 12 13 I(t < 0) 11 I(∞) 10 5 I(0) + [I(∞) − I(0)]/2 1 4 I(0) 3 2 0 t1/2 Время, t 6 Рис. 2. Восстановление интенсивности флуорес- ценции после фотоотбеливания; метод расчета дан- 7 ных ВФПФ по трем точкам: I(t < 0) – интенсивности флуоресценции до фотоотбеливания, I(0) – интен- сивности флуоресценции непосредственно после 8 фотоотбеливания, I(∞) – предельного значения ин- тенсивности флуоресценции после ее восстановле- ния. Стрелкой отмечен момент фотоотбеливания 9 чтобы вызвать фотоокисление флуоресцентной метки (иными словами, вызвать фотоотбеливание, то есть по- терю способности флуоресцировать). Вслед за этим ус- Рис. 1. Упрощенная схема установки для исследо- вания ВФПФ: 1 – лазер, 2 и 3 – аттенюаторы (осла- тановка возвращает интенсивность возбуждающего бители луча), 4 – диафрагма, 5 – дихроичное зерка- света к исходному уровню и начинает опять регистри- ло, отражающее падающий свет и пропускающее ровать интенсивность флуоресценции с отбеленного свет возбужденной флуоресценции, 6 – объектив микроскопа, 7 – исследуемая клетка, 8 – конденсор участка. Так как продукт, образующийся в результате микроскопа, 9 – осветитель, 10 – отсекающий све- фотоотбеливания флуоресцентной метки, не флуорес- тофильтр, 11 – “зонд” – узкая диафрагма, выде- цирует, то общая интенсивность флуоресценции, реги- ляющая флуоресценцию с исследуемого участка, стрируемая с этого участка, I(0), падает. Если меченые 12 – ФЭУ, 13 – блок регистрации и управления уста- новкой белки способны перемещаться в мембране, то, конеч- но, они “заплывут” и в отбеленный участок и тогда ин- использовать аргоновый лазер с λ = 488 нм). Интенсив- тенсивность флуоресценции, регистрируемой с этого ность флуоресценции метки (при λ = 520 нм) регистри- участка, I(t), будет возрастать, достигая, в конечном руется фотоэлектронным умножителем (ФЭУ), эти итоге, предельного значения I(∞). данные поступают в компьютер, который не только их По кривой восстановления флуоресценции после обрабатывает, строит графики, рассчитывает DL и дру- фотоотбеливания (см. рис. 2) можно определить время гие параметры, но и управляет всей установкой. Воз- полувосстановления, t1/2 (в точке, где интенсивность буждающий флуоресценцию луч лазера фокусируется I(∞) – I(0) флуоресценции равна I ( 0 ) + --------------------------- ). - на маленький участок плазматической мембраны (по- 2 рядка нескольких мкм2). Этот луч должен быть ослаблен Один из способов расчета коэффициента латераль- аттенюаторами (рис. 1, 2, 3 ) настолько, чтобы вызывать ной диффузии меченых белков состоит в следующем. лишь флуоресценцию метки, но не фотоокислять ее Известно, что перемещение каких-то молекул в мемб- сколько-нибудь заметно. При этом установкой реги- ране, которое удобнее характеризовать величиной сред- стрируется какая-то интенсивность флуоресценции него квадратичного перемещения 〈x2〉, за время t опи- I(t < 0), исходящей из этого маленького участка мемб- сывается формулой Эйнштейна 〈x2〉 = 4DL ⋅ t, откуда раны (рис. 2). 〈x 〉 2 Затем в момент времени t = 0 интенсивность воз- D L = --------- . - 4t буждающего луча на краткий промежуток времени (обычно десятки миллисекунд) возрастает настолько Применительно к методу ВФПФ эта формула может (аттенюаторы 2 и 3 перестают ослаблять луч, см. рис. 1), быть преобразована к виду 4 С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 4 , 2 0 0 0 БИОЛОГИЯ 2 z w 1 y D L = ---------- γ D , - x 4t 1 ⁄ 2 где w – радиус отбеливаемого участка, а γD – рассчиты- ваемая константа, зависящая от профиля луча и степе- 2 ни фотоотбеливания. Отсюда, зная время полувосста- новления t1/2 , можно вычислить DL и таким образом 9 количественно охарактеризовать подвижность белков 10 3 в мембране живой клетки. Метод ВФПФ (такая же установка, как на рис. 1) используют также и для количественной характеристи- 4 ки цитоплазменно-ядерного транспорта. В этом случае подбирают такой объектив микроскопа, чтобы фокаль- ный объем сфокусированного луча лазера совпал с объе- мом ядра исследуемой клетки, чтобы отбеливался весь 5 объем ядра (но не больше). В клетку микроинъецируют 8 6 флуоресцентно меченный исследуемый белок, а далее все происходит так же, как описано выше (см. рис. 2). 7 То есть сначала при низкой интенсивности луча реги- стрируется I(t < 0), при t = 0 происходит фотоотбели- вание того флуоресцентно меченного белка, который Рис. 3. Упрощенная схема установки для флуорес- успел попасть в ядро, затем происходят возвращение центной КЛСМ: 1 – сканируемый в трех направлени- интенсивности возбуждающего света к исходному ях предметный столик, 2 – объектив микроскопа (инвертированного), 3 – дихроичное зеркало, 4 – от- уровню и регистрация флуоресценции из отбеленного секающий фильтр, 5 – диафрагма детектора, 6 – ядра. Если меченые белки способны транспортировать- спектрограф (для выделения нужной полосы флуо- ся в ядро из цитоплазмы, то они проникнут и в отбелен- ресценции), 7 – ФЭУ, 8 – блок регистрации и управ- ный объем – ядро. Тогда интенсивность регистрируемой ления установкой, 9 – лазер, 10 – диафрагма осве- тителя флуоресценции будет расти до I(∞). В целом кинетика этого процесса обычно описывается уравнением Если один и тот же объектив используется и для ос- I(t < 0) – I(t) вещения объекта, и для детекции изображения, как на ---------------------------------- = e –kt , - I(t < 0) – I(0) рис. 3, то это условие может быть выполнено. Сущест- венным моментом является также как можно меньший где k – константа скорости цитоплазменно-ядерного диаметр диафрагмы детектора. Это достижимо при ис- транспорта; остальные обозначения даны на рис. 2 и в пользовании достаточно мощных источников освеще- пояснениях к нему в тексте. Измеряя восстановление ния, какими являются лазеры. Сочетание этих особен- флуоресценции и рассчитав k, исследователь получает ностей позволяет значительно увеличить разрешение возможность количественно охарактеризовать процесс (до 100–200 нм) и контрастность по сравнению с обыч- цитоплазменно-ядерного транспорта и сравнить раз- ной световой микроскопией. Кроме того, в случае флуо- личные факторы, воздействующие на него. ресцентной КЛСМ, которую мы и рассматриваем, лишь только та флуоресценция, которая возникает в той час- КОНФОКАЛЬНАЯ ЛАЗЕРНАЯ ти образца, на которую сфокусирован объектив, дости- СКАНИРУЮЩАЯ МИКРОСКОПИЯ (КЛСМ) гает детектора и регистрируется. В обычной же свето- Этот метод создан позже, чем метод ВФПФ: теоретиче- вой люминесцентной микроскопии детектируется ские его основы были разработаны в 1977 году, а первые флуоресценция из всей освещенной части образца, хо- установки были сконструированы спустя еще два года. тя те части, которые находятся вне фокуса, видны не- Схема установки для КЛСМ дана на рис. 3. В чем суть контрастно. Благодаря этим особенностям КЛСМ по- метода и почему он так называется? Условие конфо- является возможность послойно просматривать живые кальности, совпадение фокусов, состоит в том, чтобы клетки (наподобие томографии) и количественно ха- диафрагма детектора (рис. 3, 5) находилась в таком рактеризовать их флуоресцентные изображения. Для месте, что если ее спроецировать на объект, то ее изоб- этого необходим прецизионно перемещаемый в трех ражение точно совпало бы с фокусом освещающего направлениях, или сканируемый предметный столик объект света. (деталь 1 на рис. 3). Предметный столик передвигается С О Б О Л Е В А . С . К А К И З М Е Р Я Ю Т П О Д В И Ж Н О С Т Ь М А К Р О М О Л Е К УЛ В Ж И В Ы Х К Л Е Т К А Х 5 БИОЛОГИЯ в плоскости xy, а также по оси z. Каждое полученное нетики накопления в ядре клетки разных вариантов изображение запоминается компьютером, по этим изо- этого белка, содержащих замены разных аминокислот, бражениям компьютер воссоздает изображение каждо- фосфорилирование которых, как предполагалось, долж- го оптического среза, а также, при необходимости, лю- но сказываться на скорости транспорта белка в ядро. бого вертикального среза (например, в плоскости zx), Оказалось, что фосфорилирование одних аминокислот, что совершенно невозможно для обычной световой расположенных ближе к N-концу от сигнала ядерной микроскопии. В остальном установка для КЛСМ сходна локализации, резко ускоряло транспорт в ядро, других с установкой, изображенной на рис. 1. Количественные замедляло. Таким образом, выявились новые механиз- характеристики можно получать определяя интенсив- мы регуляции цитоплазменно-ядерного транспорта. ность флуоресценции с помощью ФЭУ из выделенных Этот же метод оказался незаменимым подспорьем окон на изображении. Например, можно выделить для экспериментального подтверждения внутрикле- квадратное окно размером 5 × 5 мкм в интересующей точной локализации лекарств при разработке путей на- части получаемого флуоресцентного изображения и правленной внутриклеточной доставки противоопухо- определить интенсивность флуоресценции, испускае- левых препаратов. мой клеткой только из этого окна. Если исследователя Удалось экспериментально подтвердить гипотезу интересует распределение макромолекул данного типа “подвижного рецептора”, высказанную в 1976 году между, скажем, ядром и цитоплазмой, то окно можно П. Кватреказасом. Оказалось, что многие рецепторы поместить в оптический срез ядра, определить интен- подвижны в плазматической мембране живых клеток, сивность флуоресценции из него (Fn), вычтя, конечно, их коэффициенты латеральной диффузии обычно ва- автофлуоресценцию, затем поместить такое же окно в рьируют в пределах 10−11–5 ⋅ 10−10 см2/с (метод ВФПФ). участок цитоплазмы на том же оптическом срезе и оп- Эти величины оказались значительно (на три-четыре ределить интенсивность флуоресценции из этого окна порядка) меньше, чем DL для белков, встроенных в ис- (Fc), тоже без автофлуоресценции. Тогда отношение кусственные мембраны. Данные различия побудили Fn исследователей искать их причины, что привело к вы- Fn ⁄ c = ------ - явлению новых, ранее неизвестных механизмов регу- Fc ляции активности мембранных белков (метод ВФПФ и будет характеризовать распределение интересующих исследования функциональной активности белков). нас флуоресцентно меченных макромолекул между яд- ром и цитоплазмой на данном оптическом срезе. ЛИТЕРАТУРА ЗАКЛЮЧЕНИЕ: ЧТО ЖЕ УДАЕТСЯ СДЕЛАТЬ 1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биоло- гия клетки. М.: Мир, 1994. Т. 2. Гл. 8, 12. С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ВФПФ и КЛСМ? Результаты экспериментальных исследований, прове- Рецензент статьи А.Н. Тихонов денных в лабораториях, создавших подобные установ- ки, оказались весьма интригующими. В рамках статьи *** трудно подробно проанализировать их, назовем лишь Александр Сергеевич Соболев, доктор биологических некоторые (каждый из приводимых примеров достоин наук, профессор кафедры биофизики биологического написания отдельной статьи). факультета МГУ, зав. лабораторией молекулярной ге- С использованием обоих методов (конечно, наряду нетики внутриклеточного транспорта Института био- с биохимическими и генно-инженерными) были каче- логии гена РАН, член-корреспондент Американской ственно и количественно описаны процессы внутрикле- ассоциации по исследованию рака, действительный точного транспорта, особенно цитоплазменно-ядерно- член Международной фотодинамической ассоциации. Область научных интересов – биофизика внутриклеточ- го. Выяснилось, что сигнал ядерной локализации – ного транспорта, медицинская биофизика, направлен- необходимый, но не единственный фактор, определя- ная внутриклеточная доставка лекарств и генетическо- ющий скорость цитоплазменно-ядерного транспорта го материала для биотехнологических и медицинских белков (например, уже упомянутого большого ядерно- целей. Автор более 160 научных работ, в том числе од- го Т-антигена вируса SV40). Методом количественной ной монографии, трех российских и шести иностран- флуоресцентной КЛСМ исследовали и сравнивали ки- ных патентов. 6 С О Р О С О В С К И Й О Б РА З О В АТ Е Л Ь Н Ы Й Ж У Р Н А Л , Т О М 6 , № 4 , 2 0 0 0 Поставщики ресурсов Авторам Контакты Обратная связь Вопросы и ответы lida kiev apartments service metabo salamander tag heuer - 32 portofino 5440.16 () 21102 touch screen 2112 iridium motorola ppg nokia 6021 1 5440.14 () 32 thuraya : 5440.14 () 5004.14 () wow contiwinterviking ipsec - . 5440.13 ()